观察生物骨骼的方法有很多种，一般主要以制作干制骨骼标本、拍摄X光与制作透明染色生物骨骼为主。干制骨骼标本制作为比较解剖学上重要的方法之一， 分离后的骨头可提供分类、演化等研究之运用。但此方法在制作过程中，常会导致部分生物骨骼组织的溶解。因此，当骨骼需要重新再组合作其他应用时，常会发生组装不易的情形，甚至发生组装上的错误。而利用X光拍摄骨骼时，虽然囿于生物体型态大小而有较多的限制，但却能够在不破坏生物外观下进行体内骨骼的观察。另外，因为影像是平面图像，要获得立体之相对位置必须多方位拍摄才行。而且X光的设备安全需求较高，人员也需通过证照考试，加上经费的需求较高，常让一般的实验室却步。
透明骨骼染色法制作的鱼标本。图片来源：《透视·鱼》
本书所利用的透明骨骼染色法，是利用特殊药品将生物体的肌肉组织透明化后，再利用特殊染剂将骨骼进行二重染色，让生物标本依骨骼成分呈现不同的红蓝两色。此方法不但能够避免在制作过程中骨骼遗失与错位的问题；费用方面也较X光照射法来得便宜许多，同时亦提供了立体的标本观察角度。
准备物品
药品：
- 10%福尔马林
- 95%酒精
- 0.1%双氧水
- 冰醋酸
- 胰蛋白酶
- 硼酸钠
- 氢氧化钾
- 茜素红
- 亚里西安蓝
- 甘油
作业器材：
- 存放标本之容器
- 镊子
- 解剖刀
- 药匙
- 电子天秤
- 量筒
透明骨骼染色法制作的鱼标本。图片来源：《透视·鱼》
制作步骤
- 标本选择：一般以体型小于20厘米的标本为佳。大型标本所需的耗材与时间花费相对较多，且建议需先将内脏去除。
- 标本固定：利用10%福马林浸泡一周时间。尽量使用新鲜的标本，保存过久会让肌肉呈现偏黄的色泽，较不美观。
- 水洗：利用流水冲洗标本数目，将标本体内之福马林固定液洗掉。
- 漂白：将标本泡在0.1%双氧水中一天。此步骤是为了将鱼体体表的色素去除。过程中需注意避免将容器密封，若密封会导制容器中压力上升以致鱼体破裂。不过有时当标本非用于学术研究时，可省略此步骤，透明后的鱼体会呈现出另一种不同的感觉。
- 酒精溶液替换1：30%酒精→50%酒精→70%酒精→95%酒精。间以30分钟至1小时更换一次为佳，用以调节鱼体内渗透压平衡。
- 软骨染色：软骨染剂制备：将冰醋酸与95%酒精以体积比1：4混合后，加入亚里西安蓝染剂至溶液成深蓝色，将标本浸泡一天即可。可藉由观察尾鳍或背鳍是否染成蓝色来辨识判定，并可避光于冰箱低温保存以延长使用的时间。
- 酒精溶液替换2：95%酒精→70%酒精→50%酒精→30%酒精→纯水。每一阶段浸泡直至标本沉入底部后再进行更换。
- 浸泡胰蛋白酶：胰蛋白酶溶液制备－将2.4g硼酸钠溶于100毫升的水中后，加入1克之胰蛋白酶即可。可利用烘箱将保存温度提升至35~40°C以提高反应的效率。约每一周更换一次以加快制作速度，直至稍见骨骼即可。）
- 浸泡0.5%氢氧化钾溶液1：用来调节于体渗透压。
- 硬骨染色：硬骨染剂制备：于0.5%氢氧化钾溶液加入茜素红至深紫色后，将标本浸泡一天即可。
- 浸泡0.5%氢氧化钾溶液2：用来将硬骨染剂进行脱色。
- 浸泡混合液：0.5%氢氧化钾：甘油=3：1。不同溶液比例下各浸泡直至鱼体沉入底部后，多等待1~2天再进行下一个阶段。
- 浸泡混合液：0.5%氢氧化钾：甘油=1：1。
- 浸泡混合液：0.5%氢氧化钾：甘油=1：3。
- 浸泡纯甘油保存：将标本放入保存容器后勿加满，需留下一些空隙，因甘油在高温下会膨胀，常容易导致液体渗出。
处理前的标本仍保有原始体色。图片来源：《透视·鱼》
软骨染色后的标本呈现蓝色。图片来源：《透视·鱼》
以蛋白酶与硬骨染剂处理后的标本呈现红蓝交替的半透明感。图片来源：《透视·鱼》
透明化完成后的标本。图片来源：《透视·鱼》
标本范例：
软骨鱼
软骨鱼的骨骼由软骨组成，为鱼类中较低阶的种类，所以在染色后鱼体会以蓝色为主。它们主要是利用鳃裂来进行气体交换，除了少部分的鲨与魟能够主动换气外，大部分的软骨鱼皆需要藉由自身的移动来让水流通过鳃裂以利气体的交换。
一般而言，软骨鱼的胸鳍都偏大，且与它们的体轴成水平，是重要的平衡器官。另外，角质鳍条的不分支不分节是软骨鱼所特有。依照体态，软骨鱼可分成扁平状的魟和鳐，以及流线型的鲨。为什么软骨鱼的脊椎骨为红色的？软骨鱼的部分骨骼，如头骨与脊椎骨，是较具钙化的部位，故会被硬骨染剂染色成红色。
广东老板鯆是具有扁平身躯的鯆鱼，喜欢底栖在深海海域里，将自己埋藏在沙泥中，只露出头顶上小小的眼睛来搜寻食物。
从标本上看，广东老板鯆好像有两双眼睛。其实是因为鱼背部的眼睛，透明化后跟位于腹部的鼻孔看起来很像。广东老板鯆的鼻孔能帮助它们感应外在环境。图片来源：《透视·鱼》
硬骨鱼
高阶硬骨鱼主要由正真骨鱼亚组所组成。随着演化的脚步，古代鱼原本水平的胸鳍开始往上移动，并且逐渐转为垂直；腹鳍则逐步往前，朝向原本胸鳍的位置移动。这样的相对位置让鱼类有更强的水体控制力，可以缓慢游动、静止不动，或是倒车。由于高阶硬骨鱼的胸鳍与体轴成垂直，因此行动较为缓慢的鱼类，其胸鳍通常会呈现宽阔或舌片状；反之速度较快的鱼类胸鳍则会成线条状或是镰刀状。
血鹦鹉是由台湾的业者在意外中将橘色双冠丽鱼(Amphilophus citrinellus)和紫红火口(Cichlasoma synspilum)杂交而成的人工鱼种。但它的尾鳍付之阙如，脊椎连续弯曲，与我们熟知的正常鱼体并不相同。近年来，血鹦鹉的外形被更进一步地培育成爱心形，来满足鱼迷的喜好。
血鹦鹉因其胖胖的身躯与可爱的三角嘴而深受民众的欢迎。图片来源：《透视·鱼》
文章题图：《透视·鱼》，时报出版。
原文发表于PanSci，文章原题：透明标本制作——《透视·鱼》作者：时报出版。转载时部分文字有修改。
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