想构建一个高表达该蛋白的原核表达质粒,应该怎么做呢?

最近要开始真刀真枪构建质粒了,不过理论虽然学习了许多,实际操作和流程还是乱成一团乱麻,还请各位高手指点完善:
因为实验材料限制原因,现在已从其他实验室求得目标蛋白TBP的一个真核表达载体,想要将构建成一个高表达该蛋白的原核表达质粒,应该怎么做呢?
能粗略想到的就是PCR,酶切,重组,表达筛选⋯⋯不过很多细节还是一团浆糊啊。
像怎么选质粒,PCR的primer选择,His tag怎么加等等,一头雾水。
请各位尽量讲细节或举例子哦,把我当成完全的小白来敲打,谢谢了

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5个答案
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冷月如霜植物细胞生物学博士生

2012-07-05 08:41

可以用pET28系列的载体做原核的(比如pET28a)

首先选择pET28a里头,你所想采用的酶切位点。要确定和你的HIS tag在同一个阅读框里。如果不在阅读框里,但又非常想用这个酶切位点,就在引物里多加1-2个碱基。

选择酶切位点要注意是自己的目标基因里所不带有的。可以用NEB CUTTER,一个在线的软件。或者直接在word里面查找相应的酶切位点。如果可以的话,尽量选择使用同一种缓冲液的。另外不建议选用XBA I,因为会被甲基化修饰,DH5a产生的质粒是切不开的。要换Dam- 的菌株转化。

选择完毕以后就去设计引物吧。我引物一般和目的基因匹配的有15个碱基长,加上6个酶切位点,看心情加1-2个保护碱基,大概总体20-25左右,送公司订购。到了以后稀释成工作浓度,然后PCR。

@Paradoxian 君补充说要确定先前的模板是cDNA还是gDNA。如果是gDNA的话,可能还要做个反转录重新获得模板,以移除内含子

PCR用高保真的酶去做,做完之后取2微升检验是否有预测大小的条带。如果有的话,纯化PCR产物,和中间载体(比如T-载体)做链接。这里要注意如果是T载体,可能需要在你的PCR产物后多做个加尾步骤(很多高保真酶产生的都是平端)

链接时测载体和片段浓度,载体与片段的分子比以1:3比较合适(摩尔数)。4度或16度链接过夜(如果质量好的话可以直接室温链接1小时)

转入大肠杆菌,比如DH5a。涂平板(记得加抗性)。第二天挑6-10个菌落做菌落PCR,看是否有阳性条带。若有,将这个菌落放至5ml LB中培养过夜。

第三天提质粒,测浓度,送测序

如果测序正确,将pET-28a和链接在T载体上的你的片段进行酶切,跑电泳,割下目的条带,回收DNA,再做一次链接,转化,鉴定,测序的工作,就OK了

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支持者: None Happinase 冷月如霜

首先,楼主要善于利用一种叫“师兄”或者“师姐”的生物:如果楼主是男生,那么找一个温柔美丽耐心脾气好的师姐多问问;如果楼主是女生,去找一个看起来还是单身的师兄辅导辅导……。这样手把手教出来的效果应该比我们码的字好很多,而且也符合实验室的自身情况。

言归正传

从玩质粒到玩细菌,@冷月如霜 月如姐已经说的很详细了嗯嗯,然后我在这里简单介(fu4)绍(xi2)一下引物设计嗯嗯。希望楼主不要觉得我啰嗦……

PCR的原理就不用细说了吧?变性→退火复性→延伸,循环播放嗯。
这里就只说一般情况下、只P一段基因(而不是一个质粒,也不是要做突变嗯)的情况。

一个(一对)好的引物要确保PCR正常进行,为了做到这个它(们)必须满足以下几点:

两端引物的熔链温度(TM值)基本相同(大概在五六十度左右),确保退火准备延伸的时候两个引物都能跟目的基因的单链结合好;
两端引物的序列具有特异性,也就是说这段基因上没有其它可能会被它结合的地方,两个引物之间也不能互补得太多;
根据需要在引物两端加上相应的酶切位点,要求这样的位点在这段基因上没有(否则酶切的时候基因也被切了),并且保证这样的位点不会影响质粒的功能(比方说你不能把它的抗性基因给破坏了);
为了防止引物端点处的单联落单时不安分,往往会加上1-3个保护碱基,具体保护碱基的选取……问问你的师兄师姐,他们那里应该会有那种与不同菌种、质粒相对应的保护碱基的效果表之类的东西……

会有相关的软件协助你完成以上几点,我用的是(其实我是从师兄那里拷的)omiga(不过好像matlab也可以……具体怎么用还不会(ˉ(∞)ˉ)……)。

如果要加tag的话,把cDNA序列上的终止密码子去掉再把tag的序列加上就好了吧……然后这一坨就是所谓的目的基因

把目的基因的序列弄进omiga以后就可以开始设计引物了。引物长度一般在15-25左右,两端引物长度不一定要相同,具体多少可以根据以下条件进行调整:

先选取目的基因两端的15-25bp之间的任意长度序列放在输入栏里(记得顺序要对),加上相应酶切位点以后,可以让软件帮你算一下二者①TM值是否合适(一般来说五六十度)并相同(主要是GC碱基对在序列中的的比例(三个氢键,你懂的)影响),②和目的基因其他片段是否有可以匹配的部分(如果有尽量避免)。然后根据软件算出来的这些结果,增删相应端的碱基对或者加上保护碱基,几番调整之后当上述几个方面都令人满意了就可以下单了。

另外,PCR时的退火温度一般设置得比引物的熔链温度低2~3℃就好,延伸时间可以根据公司给你的连接酶的工作效率和目的基因的长度自己做除法,稍稍久一点没关系的,因为酶不一定有公司告诉你的那么高效=。=。


至于高表达…………这个可不只是构建一个质粒就可以完事了的。楼主需要各种尝试,直到试出来相对最合适的质粒、位点、tag、菌种、培养基、培养条件(比方说多少温度下摇多久,什么时候诱导,怎么诱导etc)的组合…………这个过程就相对比较漫长了=。=……

回头一看发现写了好多……我果然好啰嗦=。=………………

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有真核表达载体了?额,我没做过真核的,但是应该不能用在原核的上吧,那就设计带酶切位点的引物把片段弄出来吧,然后PCR纯化,得到基因片段。原核表达载体就太多了,常用的HIS标签的pET系列和GST标签的pGEX系列,基本每个实验室都有,设计引物的时候没切位点考虑你用的载体上有什么酶切位点,粘端还是好做,真如果倒霉你的片段上各种酶切位点都包括了,那就平端酶切吧,还得鉴定正反向,不过也能做。摇宿主菌提质粒双切胶回收,然后就连接转化鉴定,然后再提质粒转化表达宿主诱导表达。PAGE鉴定,根据你的需要优化诱导条件。。。。。。靠这说道太多了,真说就成写书了,你还是百度一下吧,搜“pET系统手册”有中文版,可以给你很多启发,祝好运。pET系统理论上高表达能达到细胞干重的一半,但是实际上很难达到,我的体会一般10ml培养物最终能纯化出1mg就不错了吧。

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有真核表达载体就方便多了,直接用该载体质粒做模板PCR扩增比较方便。
甚至,如果真核载体目的片段两端有合适的酶切位点(原核载体里也有的,不酶切目的片段自身的酶切位点),可以不用PCR获得目的片段,直接扩大培养真核载体,然后选择两种载体里共有的酶切位点,酶切,纯化得到目的片段,再连接到同时酶切好的原核载体中去。

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无聊的耗子大家眼中修拖拉机的

2012-07-05 21:33

工科男路过~~~为了能和女盆友沟通,学习学习~~~

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