灵长类动物的克隆绝对是生命科学领域最让人绝望的技术难题之一。
一场细胞中的小小“政变”
生物体内的各种细胞都像是一个个小王国，细胞核就是这蜗角之地的国王，而细胞里的其它成分就是臣民。一般来说，细胞里面是“君民同心”的，但是如果把原来的细胞核取走，换一个别的细胞核进去，对于一般的细胞来说，“统治阶级”变了天，那下头也只能跟着改。然而，有一种细胞它不一般，那就是卵细胞。
作为动物体内最大的细胞，卵细胞里除了细胞核依旧只有孤零零的一个之外，各种细胞器和其它细胞成分全都人多势众。因此卵细胞核的“威信”与别的细胞核相比就“弱”得多——就算是新换的领导，也会被倒逼着改变立场。1964年，英国科学家约翰·戈登（John Gurdon）就拿非洲爪蟾做了一次这样的实验，他用爪蟾的体细胞核替换掉了爪蟾卵的细胞核[1]。果然，一开始那个体细胞核还在痴心妄想指挥卵细胞做体细胞的工作，但是很快就架不住“众怒难犯”，转型成了卵细胞核，甚至还能指挥这个卵细胞发育成正常的爪蟾个体。
克隆（体细胞核移植重编程）技术的发明人约翰·戈登。图片来源：维基百科
这种更换细胞核的操作就叫“核移植”，而倒逼细胞核转型的现象，有点类似于给电脑硬件修改程序，因此就被称为“重编程”。因此“克隆”的专业名称叫做“体细胞核移植重编程”。
1996年，苏格兰降生了一头名叫“多莉”的小羊，从此证明了哺乳动物也是可以克隆的。人也是哺乳动物，那么，理论上，人也是可以克隆的。
克隆技术示意图。制图：鬼谷藏龙
当然，克隆人显然是伦理所不容的，但是克隆猴子——人类的亲戚——可就不同了。更重要的是，猴子是神经科学领域不可或缺的实验动物。如果打开看各种动物的脑子，其它实验动物比如小白鼠的脑子那都跟打过除皱针似的光滑无比，跟千沟万壑的人脑显然不是一个配置，放眼整个自然界，也只有猿猴的大脑能与人类比肩。
更重要的是，由于亲缘关系接近，猴子们的思维方式也和人类相似。一方面，这为一些疾病的研究提供了便利，比如要是用老鼠研究抑郁症，就不免会遇到“你咋就知道这只老鼠抑郁”的问题，因为发病症状不一样啊。猴子就不会。
另一方面，猴子能模拟许多人类的行为和决策，经过训练的猴子甚至可以跟人下棋打牌（当然是比较简单的类型，不过你也不一定玩得过它们）。它们甚至不用训练就懂得“看人脸色”——实验室里相当一部分猴子都知道研究生可以欺负，但是导师可惹不起。
我们至今都对这些复杂思维背后的神经学机制一无所知，一旦克隆猴技术得到突破，没准到头来人们还会破解大脑作出决策的“算法”——如果大脑将外界刺激转化为特定决策真的有规律可循，怕是连人类数千年来固守的“自由意志”都将受到动摇。
因此甚至在多莉羊还没诞生之前，人们就已经开始尝试克隆猴子了。然而，谁也没想到，克隆猴竟然是个史诗级巨坑。
百舸争流，无人能及
在克隆羊之后不过几年，小鼠，猪，牛，马，狗以及喵主子都被成功克隆了出来，可这克隆猴却始终一丁点动静也没有。这可不能怪科学家不努力，克隆猴的巨大意义就这么放着，学术界对此可谓是百舸争流，全世界最顶尖的科学家有条件的都上了，没条件的制造条件也要上。
这其中最值得一提的是美籍哈萨克斯坦科学家沙乌科莱特·米塔利波夫（Shoukhrat Mitalipov），他的导师唐·沃尔夫（Don P. Wolf）早在1997年就曾经利用卵裂球的细胞核做过“克隆猴”[2]，所谓卵裂球就是受精卵早期分裂（二细胞期到八细胞期）的产物，本身就能发育成完整个体（多胞胎就可能由几个卵裂球发育而来）。从这个意义上讲，卵裂球的细胞核与卵子的细胞核本来就一样，因此用卵裂球的细胞核取代卵细胞的细胞核做克隆只涉及“核移植”而无关“重编程”，因此这种“克隆猴”更接近于人造同卵多胞胎猴。
沙乌科莱特·米塔利波夫。图片来源：wikimedia.org
米塔利波夫接过了他导师的衣钵，在克隆猴的道路上也走得更远。米塔利波夫就职于世界最顶尖的非人灵长类研究机构——美国俄勒冈健康与科学大学（Oregon Health and Science University）。二十多年来，他几乎就只专注于克隆猴这一件事。2011年，他首次发现咖啡因可以提升核移植重编程效率，并由此第一个制造出了猕猴的克隆胚胎干细胞[3]，这在当时也是非常重大的突破了，他曾是全世界最被寄予厚望第一个克隆出猴子的人。
然而现实是残酷的，克隆的风潮在21世纪之后开始逐渐冷却，尤其是遭受韩国“黄禹锡事件”的冲击后可谓江河日下，包括克隆技术之父戈登在内的很多科学家都转向了其它领域。
2012年，CRISPR/Cas9技术的诞生更是让人觉得给克隆技术判了死刑。原本克隆最大的优势在于制作基因编辑动物，因为克隆相当于是将养在盘子里的细胞变成养在笼子里的动物。细胞有什么样的基因，动物就也有一模一样的基因，这对于制造基因编辑动物而言意义重大，因为人们编辑体外培养的细胞的基因非常容易，而编辑动物个体的基因则极为困难，因此克隆曾是制作基因编辑动物为数不多的技术选择之一。
但是CRISPR/Cas9改变了这一切，这个基因编辑技术极为高效，在小鼠等动物身上很轻松就能直接编辑动物个体的基因，那还要克隆作甚？
蓦然回首，柳暗花明
一时之间，原本的熙熙攘攘变得门庭冷落，放眼全世界，也只剩少数几个研究机构还在继续坚持。这其中包括米塔利波夫的实验室，也包括一些来自中国的实验室。而希望也正燃起于绝望之中。
在中国新近立项的“中国脑计划”[4]中，基因编辑非人灵长类被放在了核心位置。一开始，大家的想法自然是，既然猴子貌似根本无法克隆，那么就用CRISPR/Cas9来编辑猴子的基因好了。
然而猴子貌似就是有某种非要跟新技术过不去的体质，克隆搞不定，CRISPR/Cas9居然也不是很给力。在小鼠身上运行流畅的技术移植到猴子身上，效率少说降个九成。2014年，昆明动物所的季维智研究员率先将CRISPR/Cas9用在猕猴身上，结果效率低得可怕，猕猴浑身上下的的细胞中被成功编辑只有微乎其微的一丁点，得用很精密的生物学检测手段才能查出来。
虽然后来，中国科学家经过一系列改进，将基因编辑猴推进到了能够实用的程度，也走进了国际前列，比如制造出过带有特定遗传病的猴子模型。但是这些技术改进多少都有点“得之桑榆，失之东隅”的意思——虽说能造出想要的猴子，但也存在制作周期漫长或是适用范围狭隘等问题。
这时蓦然回首，人们才发现克隆技术其实并未过时，它依然是制造基因编辑猴模型的最佳选项。但这毕竟是个国际难题，单单是承接这个课题就需要巨大的勇气。米塔利波夫兢兢业业钻研了二十多年，但是临门一脚死活踢不进去；以杨辉博士等为代表的中国科学家也曾设计过一些“曲线救国”的方案，但是后来也未能如愿以偿。
之所以灵长类的克隆如此艰难，很大程度上是因为灵长类动物的卵和细胞核都特别矫情。一方面，灵长类的卵极为敏感，哪怕是简单的挤压都会导致其异常分裂，那么你要把它挖开来吸走细胞核，又要塞个野路子细胞核进去，这么一通操作下来还不跟你玩命？另一方面，灵长类的细胞核非常恋旧，就算你给它换了工作岗位，却怎也做不通它的思想工作，重编程无论如何都不彻底，指挥胚胎发育的时候心猿意马，以至于总会“胎死腹中”。
去除卵母细胞的细胞核。视频来源：参考文献[6]
之前，米塔利波夫在克隆操作中引入咖啡因的做法大致解决了前一个问题，咖啡因是一种蛋白磷酸酶抑制剂，它可以暂时抑制卵细胞中的某些信号通路，让卵细胞在“大权交接”期间基本保持稳定。不过咖啡因等小分子存在毒性问题，这次的克隆猴并未采用咖啡因的方案，而是采用一种不会挤压到卵细胞的特殊核移植方法，直接降低对卵子的刺激。
而灵长类体细胞难以彻底重编程这个问题的解决，则得感谢另一位华裔科学家，来自哈佛大学医学院、加州大学圣迭戈分校的张毅博士。他发现细胞核这种执念的本质在于其表观遗传学修饰，也就是细胞DNA上一些特殊的化学标记。如果在克隆的过程中加入一种叫做Kdm4d的酶，就可以“擦掉”体细胞核基因的一些关键的表观遗传修饰，让这枚体细胞核 “洗心革面，重新做核”[5]。
本次克隆猴的实验设计。图片来源：参考文献[6] | 翻译：鬼谷藏龙
顺着张毅博士的思路，中国科学院神经科学研究所的孙强博士和刘真博士一起改进了克隆猴技术——他们成功地利用Kdm4d“洗脑”了猴子的体细胞核，终于使之得以全心全意指导猴子的胚胎发育。
不过理论归理论，实际的摸索还是很艰巨的，孙强与刘真师徒俩为此奋斗了超过三年，尝试了超过三百次核移植后才终于诞生了世界上首例，两只，克隆猴[6]。中中和华华，这两个名字，也代表了中国科学家的自信。
这次中国科学家克隆的两只猴子，中中和华华。图片来源：参考文献[6]
中国领跑，有望开启人类疾病研究的新时代
曾经，中国的神经科学研究在国际上是根本排不上号的。在中国科学院神经科学研究所所长蒲慕明刚刚回国的时候，国际一二线的神经科学期刊已经几十年都没出现过中国科研机构的名称了。二十年的努力，让中国也终于迈入了国际神经科学大国的行列，能够与其他国家“并跑”了，而克隆猴的突破则一举奠定了“中国脑计划”乃至整个神经科学领域新时代研究的基石。蒲慕明对此非常激动地表示，从此中国神经科学家再也不单单是“并跑”了，我们将“领跑”整个世界。
从上向下，分别是中科院神经科学研究所所长蒲慕明，论文通讯作者孙强和第一作者刘真。图片来源：中国科学院神经科学研究所
从中国科学院，从中国这里开始，神经科学研究将迈入“基因编辑非人灵长类”的时代。猴子也会出现非常类似于人类的脑部疾病，包括孤独症、抑郁症、帕金森病以及不久前很火的“渐冻人”等等，这一切都可以利用基因编辑与克隆技术迅速制作出相关的猴模型。借助这样的动物模型，科学家可以在与人类更加相似的平台上研究疾病的发病机制，试验新的治疗方法。人们对这些疾病的理解将出现质的飞跃。
有了克隆猴，人们也终于可以随心所欲地在灵长类动物的身上应用“光遗传”等技术，在基因和神经环路层面洞悉灵长类的大脑——这对于理解我们人类的大脑有着非比寻常的意义。
还有如今很火的基因治疗，在此之前由于几乎不可能制造出带有遗传病的猴模型，因此基因治疗的概念在动物实验和人体实验之间一直存在着巨大的鸿沟，少数在人体上的尝试也面临了巨大的伦理指责。而现在，这一切都将成为过往。说不定，在未来的医院，维修基因也会像维修一般的器官一样必备的科目。
而我们，有幸见证了一个伟大时代的开始，更可以期待一个更加美好的未来。（编辑：明天）
参考资料
- Gurdon, J.B. (1962). The developmental capacity of nuclei taken from intestinal epithelium cells of feeding tadpoles. J. Embryol. Exp. Morphol. 10, 622–640.
- Meng, L., Ely, J. J., Stouffer, R. L., & Wolf, D. P. (1997). Rhesus monkeys produced by nuclear transfer. Biology of reproduction, 57(2), 454-459.
- Byrne, J. et al. (2007). Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature, 450(7168).
- 蒲慕明, 徐波, 谭铁牛.脑科学与类脑研究概述[J]. 中国科学院院刊, 2016, 31(7): 725-736
- Chung YG et al. (2015). Histone Demethylase Expression Enhances Human Somatic Cell Nuclear Transfer Efficiency and Promotes Derivation of Pluripotent Stem Cells.Cell Stem Cell. 3;17(6):758-766.
- Liu, Z. et al. (2018). Cloning of macaque monkeys by somatic cell nuclear transfer. Cell